PCR—生物學的聚合酶鏈反應

發布時間:2017-08-28 10:55  來源: 本站原創  閱讀次數: 1590

聚合酶鏈式反應是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點,是能將微量的DNA大幅增加。因此,無論是化石中的古生物、歷史人物的殘骸,還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛發、皮膚或血液,只要能分離出一丁點的DNA,就能用PCR加以放大,進行比對。這也是"微量證據"的威力之所在。由1983年美國Mullis首先提出設想,1985年由其發明了聚合酶鏈反應,即簡易DNA擴增法,意味著PCR技術的真正誕生。到如今2013年,PCR已發展到第三代技術。1973 年,臺籍科學家錢嘉韻,發現了穩定的Taq DNA聚合酶,為PCR技術發展也做出了基礎性貢獻。

PCR(聚合酶鏈式反應)是利用DNA在體外攝氏95°高溫時變性會變成單鏈,低溫(經常是60°C左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合,再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72°C左右),DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。基于聚合酶制造的PCR儀實際就是一個溫控設備,能在變性溫度,復性溫度,延伸溫度之間很好地進行控制。

 

發展簡史

人類對于核酸的研究已經有100多年的歷史。20世紀60年代末70年代初,人們致力于研究基因的體外分離技術。但是,由于核酸的含量較少,一定程度上限制了DNA的體外操作。Khorana于1971年最早提出核酸體外擴增的設想。但是,當時的基因序列分析方法尚未成熟,對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現,寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段,這種想法似乎沒有任何實際意義。

1985年,美國科學家Kary Mullis在高速公路的啟發下,經過兩年的努力,發明了PCR技術,并在Science雜志上發表了關于PCR技術的第一篇學術論文。從此,PCR技術得到了生命科學界的普遍認同,Kary Mullis也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。

但是,最初的PCR技術相當不成熟,在當時是一種操作復雜、成本高昂、“中看不中用”的實驗室技術。1988年初,Keohanog通過對所使用的酶的改進,提高了擴增的真實性。而后,Saiki等人又在黃石公園從生活在溫泉中的水生嗜熱桿菌內提取到一種耐熱的DNA聚合酶,使得PCR技術的擴增效率大大提高。也正是由于此酶的發現使得PCR技術得到了廣泛地應用,使該技術成為遺傳與分子生物學 分析的根本性基石。在以后的幾十年里,PCR方法被不斷改進:它從一種定性的分析方法發展到定量測定;從原先只能擴增幾個kb的基因到目前已能擴增長達幾十個kb的DNA片段。到目前為止,PCR技術已有十幾種之多,例如,將PCR與反轉錄酶結合,成為反轉錄PCR,將PCR與抗體等相結合就成為免疫PCR等。

 

技術原理

DNA的半保留復制是生物進化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶啟動子的參與下,根據堿基互補配對原則復制成同樣的兩分子拷貝。在實驗中發現,DNA在高溫時也可以發生變性解鏈,當溫度降低后又可以復性成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復性,并設計引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復制。

但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環都得加入新的DNA聚合酶,不僅操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術的應用和發展。發現耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環加酶,使PCR技術變得非常簡捷、同時也大大降低了成本,PCR技術得以大量應用,并逐步應用于臨床。

 

工作原理

類似于DNA的天然復制過程,其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火(復性)--延伸三個基本反應步驟構成:①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至90~95℃一定時間后,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引物結合,為下輪反應作準備;②模板DNA與引物的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈后,溫度降至50~60℃,引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;③引物的延伸:DNA模板--引物結合物在DNA聚合酶的作用下,于70~75℃,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按堿基配對與半保留復制原理,合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程,就可獲得更多的“半保留復制鏈”,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

 

反應特點

特異性強

PCR反應的特異性決定因素為:

①引物與模板DNA特異正確的結合;

②堿基配對原則;

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;

④靶基因的特異性與保守性。

其中引物與模板的正確結合是關鍵。引物與模板的結合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引物的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。

靈敏度高

PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=10-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好后,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。

對標本的純度要求低

不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

 

其他資料:

反應五要素

參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+

引物:引物是PCR特異性反應的關鍵,PCR 產物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,只要知道任何一段模板DNA序列, 就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物,利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。

設計引物應遵循以下原則:

①引物長度:15-30bp,常用為20bp左右。

②引物擴增跨度:以200-500bp為宜,特定條件下可擴增長至10kb的片段。

③引物堿基:G+C含量以40-60%為宜,G+C太少擴增效果不佳,G+C過多易出現非特異條帶。ATGC最好隨機分布,避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

④避免引物內部出現二級結構,避免兩條引物間互補,特別是3'端的互補,否則會形成引物二聚體,產生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基,特別是最末及倒數第二個堿基,應嚴格要求配對,以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點, 被擴增的靶序列最好有適宜的酶切位點, 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性:引物應與核酸序列數據庫的其它序列無明顯同源性。引物量:每條引物的濃度0.1~1umol或10~100pmol,以最低引物量產生所需要的結果為好,引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,且可增加引物之間形成二聚體的機會。

反應體系與反應條件

標準的PCR反應體系:

10×擴增緩沖液10ul

4種dNTP混合物各200umol/L

引物各10~100pmol

模板DNA0.1~2ug

TaqDNA聚合酶2.5u

Mg2+1.5mmol/L

加雙或三蒸水至100ul

PCR反應五要素:參加PCR反應的物質主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和緩沖液(其中需要Mg2+)

PCR反應條件的選擇

PCR反應條件為溫度、時間和循環次數。

溫度與時間的設置:基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,雙鏈DNA在90~95℃變性,再迅速冷卻至40 ~60℃,引物退火并結合到靶序列上,然后快速升溫至70~75℃,在Taq DNA 聚合酶的作用下,使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100~300bp時)可采用二溫度點法, 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,一般采用94℃變性,65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間:變性溫度低,解鏈不完全是導致PCR失敗的最主要原因。一般情況下,93℃~94℃min足以使模板DNA變性,若低于93℃則需延長時間,但溫度不能過高,因為高溫環境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產物完全變性,就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間:退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃~60℃,可使引物和模板發生結合。由于模板DNA 比引物復雜得多,引物和模板之間的碰撞結合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,取決于引物的長度、堿基組成及其濃度,還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,G+C含量約50%的引物,55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度:

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)+2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5~10℃)

在Tm值允許范圍內, 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結合, 提高PCR反應的特異性。復性時間一般為30~60sec,足以使引物與模板之間完全結合。

③延伸溫度與時間:Taq DNA聚合酶的生物學活性:

70~80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時, DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70~75℃之間,常用溫度為72℃,過高的延伸溫度不利于引物和模板的結合。PCR延伸反應的時間,可根據待擴增片段的長度而定,一般1Kb以內的DNA片段,延伸時間1min是足夠 的。3~4kb的靶序列需3~4min;擴增10Kb需延伸至15min。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現。對低濃度模板的擴增,延伸時間要稍長些。

酶及其濃度

目前有兩種Taq DNA聚合酶供應, 一種是從棲熱水生桿菌中提純的天然酶,另一種為大腸菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反應約需酶量2.5U(指總反應體積為100ul時),濃度過高可引起非特異性擴增,濃度過低則合成產物量減少。

dNTP的質量與濃度 dNTP的質量與濃度和PCR擴增效率有密切關系,dNTP粉呈顆粒狀,如保存不當易變性失去生物學活性。dNTP溶液呈酸性,使用時應配成高濃度后,以1M NaOH或1M Tris。HCL的緩沖液將其PH調節到7.0~7.5,小量分裝, -20℃冰凍保存。多次凍融會使dNTP降解。在PCR反應中,dNTP應為50~200umol/L,尤其是注意4種dNTP的濃度要相等( 等摩爾配制),如其中任何一種濃度不同于其它幾種時(偏高或偏低),就會引起錯配。濃度過低又會降低PCR產物的產量。dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。

模板(靶基因)核酸 模板核酸的量與純化程度,是PCR成敗與否的關鍵環節之一,傳統的DNA純化方法通常采用SDS和蛋白酶K來消化處理標本。SDS的主要功能是:溶解細胞膜上的脂類與蛋白質,因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜,并解離細胞中的核蛋白,SDS 還能與蛋白質結合而沉淀; 蛋白酶K能水解消化蛋白質,特別是與DNA結合的組蛋白,再用有機溶劑酚與氯仿抽提掉蛋白質和其它細胞組份,用乙醇或異丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作為模板用于PCR反應。一般臨床檢測標本,可采用快速簡便的方法溶解細胞,裂解病原體,消化除去染色體的蛋白質使靶基因游離,直接用于PCR擴增。RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法,要防止RNase降解RNA。

Mg2+濃度 Mg2+對PCR擴增的特異性和產量有顯著的影響,在一般的PCR反應中,各種dNTP濃度為200umol/L時,Mg2+濃度為1.5~2.0mmol/L為宜。Mg2+濃度過高,反應特異性降低,出現非特異擴增,濃度過低會降低Taq DNA聚合酶的活性,使反應產物減少。

 

工作步驟

標準的PCR過程分為三步(如圖所示):

1.DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下,氫鍵斷裂,形成單鏈DNA

2.退火(復性)(40℃-65℃):系統溫度降低,引物與DNA模板結合,形成局部雙鏈。

3.延伸(68℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP為原料,從引物的5′端→3′ 端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。

現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內復制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。

 

循環參數

1、預變性(Initial denaturation).

模板DNA完全變性對PCR能否成功至關重要,一般95℃加熱3-5分鐘。

2、引物退火(Primer annealing)

退火溫度一般需要憑實驗(經驗)決定。

退火溫度對PCR的特異性有較大影響。

3、引物延伸

引物延伸一般在72℃進行(Taq酶最適溫度)。

延伸時間隨擴增片段長短及所使用Taq酶的擴增效率而定。

4、循環中的變性步驟

循環中一般95℃,30秒足以使各種靶DNA序列完全變性:

變性時間過長損害酶活性,過短靶序列變性不徹底,易造成擴增失敗。

5、循環數

大多數PCR含25-35循環,過多易產生非特異擴增。

6、最后延伸

在最后一個循環后,反應在72℃維持5-15分鐘.使引物延伸完全,并使單鏈產物退火成雙鏈。

PCR-PCR常見問題

 

電泳檢測時間

一般為48h以內,有些最好于當日電泳檢測,大于48h后帶型不規則甚至消失。

假陰性,不出現擴增條帶

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的制備,②引物的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消 化除凈,特別是染色體中的組蛋白,④在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。在酶和引物質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩定的消化處理液,其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引物:引物質量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質量有問題,兩條引物一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現,而且兩引物帶的亮度應大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引物合成單位協商解決。如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引物變質降解失效。④引物設計不合理,如引物長度不夠,引物之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變:通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應用多 大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

 

物理原因

變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引物與模板特異性結合,或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。假陽性出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。引物設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短,容易出現假陽性。需重新設計引物。

靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引物互補后,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶

PCR擴增后出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引物與靶序列不完全互補、 或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引物量,適當增加模板量,減少循環次 數。適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃 度。增加模板量,減少循環次數。

 

克隆PCR產物

1)克隆PCR產物的最優條件是什么?

最佳插入片段:載體比需實驗確定。1:1(插入片段:載體)常為最佳比,摩爾數比1:8或8:1也行。應測定比值范圍。連接用5ul 2X連接液,50ng質粒DNA,1Weiss單位的T4連接酶,插入片段共10ul。室溫保溫1小時,或4℃過夜。在這2種溫度下,缺T-凸出端的載體會自連,產生藍斑。室溫保溫1小時能滿足大多數克隆要求,為提高連接效率,需4℃過夜。

2)PCR產物是否需要用凝膠純化?

如凝膠分析擴增產物只有一條帶,不需要用凝膠純化。如可見其他雜帶,可能是積累了大量引物的二聚體。少量的引物二聚體的摩爾數也很高,這會產生高比例的帶有引物二聚體的克隆,而非目的插入片段。為此需在克隆前做凝膠純化。

3)如果沒有回收到目的片段,還需要作什么對照實驗?

A)涂布未轉化的感受態細胞。

如有菌落,表明氨芐失效,或污染上帶有氨芐抗型的質粒,或產生氨芐抗型的菌落。

B)轉化完整質粒,計算菌落生長數,測定轉化效率。

例如,將1ug/ul質粒1:100稀釋,1ul用于100ul感受態細胞轉化。用SOC稀釋到1000ul后,用100ul鋪板。培養過夜,產生1000個菌落。轉化率為:產生菌落的總數/鋪板DNA的總量。

鋪板DNA的總量是轉化反應所用的量除以稀釋倍數。具體而言轉化用10ng DNA,用SOC稀釋到1000u后含10 ng DNA,用1/10鋪板,共用1 ng DNA。轉化率為:

1000克隆X10(3次方) ng /鋪板1 ng DNA ug=10(6次方)cfu/ ug

轉化pGEM-T應用10(8次方)cfu/ ug感受態細胞

如沒有菌落或少有菌落,感受態細胞的轉化率太低。

C)如用pGEM-T正對照,或PCR產物,產生>20-40藍斑(用指定步驟10(8次方)cfu/ ug感受態細胞),表明載體失去T。可能是連接酶污染了核酸酶。T4 DNA連接酶(M1801,M1804,M1794)質量標準好無核酸酶污染,不應用其它來源的T4 DNA連接酶替換。

D)用pGEM-T或pGEM-T Easy載體,連接pGEM-T正對照,轉化高頻率感受態細胞(10(8次方)cfu/ug),按照指定的實驗步驟,可得100個菌落,其中60%應為白斑,如產生>20-40藍斑,沒有菌落或少有菌落,連接有問題。

4)對照實驗結果好,卻沒有回收到目的片段,實驗出了什么問題?

A)連接用室溫保溫1小時,能滿足大多數克隆,為提高效率,需4℃過夜。

B)插入片段帶有污染,使3`-T缺失,或抑制連接,抑制轉化。為此,將插入片段和pGEM-T正對照混合,再連接。如降低了對照的菌落數,插入片段需純化,或重新制備。如產生大量的藍斑,插入片段污染有核酸酶,使pGEM-T或pGEM-T Easy載體3`-T缺失。

C)插入片段不適于連接。用凝膠純化的插入片段,因受UV過度照射,時有發生。UV過度照射會產生嘧啶二聚體,不利于連接,DNA必需重新純化。

D)帶有修復功能的耐熱DNA聚合酶的擴增產物末端無A,后者是pGEM-T或pGEM-T Easy載體克隆所需。加Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加A。詳情查pGEM-T pGEM-T Easy載體技術資料(TM042)。

E)高度重復序列可能會不穩定,在擴增中產生缺失和重排,如發現插入片段高頻率地產生缺失和重排,需用重組缺陷大腸桿菌菌株,如SURE細胞

 

 



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